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Résumé Contexte L'imagerie spectrale avec des sondes fluorescentes sensibles à la polarité permet la quantification des propriétés physiques des cellules et des membranes modèles, y compris l'hydratation locale, la fluidité et le remplissage lipidique latéral, généralement caractérisés par le paramètre de polarisation généralisée (GP). Avec le développement de microscopes commerciaux équipés de détecteurs spectraux, l'imagerie spectrale est devenue une technique pratique et puissante pour mesurer la GP et d'autres propriétés de membrane. Cependant, les outils existants pour le traitement d'images spectrales sont insuffisants pour traiter les grands ensembles de données offerts par cette avancée technologique et ne conviennent pas pour le traitement d'images acquises avec des sondes fluorescentes rapidement internalisées. Résultats Nous présentons ici une boîte à outils d'imagerie spectrale MATLAB dans le but de surmonter ces limitations. En plus des opérations courantes, telles que le calcul des distributions des valeurs GP, la génération de cartes GP pseudo-colorées et l'analyse spectrale, un des points forts de cet outil est la segmentation fiable de la membrane pour les sondes qui sont rapidement internalisées. En outre, la gestion des hyperstacks, la reconstruction 3D et le traitement par lots facilitent l'analyse des ensembles de données générés par les opérations de microscopie en série chronologique, en pile Z et à balayage de zone. Enfin, la distribution de la taille de l'objet est déterminée, ce qui peut fournir un aperçu des mécanismes sous-jacents aux changements des propriétés de la membrane et est souhaitable pour e. g. études portant sur des membranes modèles et des particules enrobées de surfactant. L'analyse est démontrée pour les membranes cellulaires, les vésicules dérivées de cellules, les membranes modèles et les microbulles avec des sondes respectueuses de l'environnement Laurdan, Laurdan à modification carboxyle (C-Laurdan), Di-4-ANEPPDHQ et Di-4-AN (F) EPPTEA (FE), pour la quantification de la densité latérale locale des lipides ou du garnissage lipidique. Conclusions La boîte à outils d'imagerie spectrale est un outil puissant pour la segmentation et le traitement de grands ensembles de données d'imagerie spectrale avec une méthode fiable pour la segmentation de la membrane et aucune capacité de programmation requise. La boîte à outils d'imagerie spectrale peut être téléchargée à partir de. Contexte Un nombre croissant de preuves suggère que la réorganisation dynamique des lipides dans les membranes cellulaires peut compartimenter les protéines membranaires, influençant la réponse d'une cellule aux stimuli extracellulaires et sa perméabilité membranaire [1, 2]. Il s'ensuit que des agents porteurs de médicaments, tels que des liposomes ou des microbulles de gaz, avec des compositions lipidiques optimisées peuvent exploiter ces processus pour une meilleure délivrance de médicaments via la fusion membranaire ou la perméabilisation membranaire [3 - 5]. Pour faciliter la caractérisation de ces dispositifs d'administration de médicaments et approfondir notre compréhension de la biologie fondamentale de la membrane cellulaire, une méthode non destructive pour évaluer les propriétés physicochimiques intrinsèques de la membrane est nécessaire. Par exemple, le remplissage ou l'ordre moléculaire des lipides membranaires peut être détecté par des sondes fluorescentes sensibles à la polarité telles que Laurdan ou Di-4-ANEPPDHQ, dont le spectre d'émission change en réponse aux changements de l'ordre moléculaire de l'environnement membranaire, généralement quantifiés par un paramètre noté Polarisation généralisée (GP) [6 - 11]. Avec l'avènement des microscopes commerciaux équipés de détecteurs spectraux, les changements dans les spectres d'émission de fluorescence, et donc le paramètre GP, peuvent désormais être déterminés avec une précision spatiale beaucoup plus élevée en utilisant l'imagerie spectrale [10]. En raison de l'internalisation de nombreuses sondes fluorescentes sensibles à la polarité dans les cellules vivantes, cependant, la segmentation de la membrane doit être effectuée pour mesurer avec précision le remplissage lipidique de la membrane et pour éliminer les contributions cytosoliques [7, 12]. La segmentation de la membrane est souvent effectuée à l'aide d'un fluorophore secondaire, ce qui augmente le coût et la complexité expérimentaux. À cette fin, nous avons développé la Spectral Imaging Toolbox, une boîte à outils pour l'analyse spectrale avec une segmentation de membrane fiable sans avoir besoin d'une sonde d'imagerie secondaire. Dans la boîte à outils d'imagerie spectrale, nous avons inclus le traitement par lots et hyperstack ainsi que la reconstruction 3D de piles z confocales pour faciliter le traitement de grands ensembles de données et des expériences avec des expositions multiples. Nous démontrons l'utilité de cet outil avec des images de vésicules géantes de membrane plasmique (GPMV, vésicules dérivées de cellules) marquées avec Laurdan sensible à la polarité ou Di-4-ANEPPDHQ, des images de cellules cancéreuses vivantes et de microbulles marquées avec Laurdan modifié par un groupe carboxyle ( C-Laurdan) et des vésicules unilamellaires géantes (GUV) marquées au Di-4-AN (F) EPPTEA (FE). En plus des colorants Laurdan et Di-4-ANEPPDHQ les plus couramment utilisés, nous avons choisi FE et C-Laurdan pour leur photostabilité supérieure et leur gamme de spectre d'émission [8, 12]. Mise en œuvre La boîte à outils d'imagerie spectrale a été conçue pour l'analyse spectrale d'images à fort grossissement de cellules, vésicules et microbulles simples ou sub-confluentes dans MATLAB [13]. Entrées et sorties En imagerie spectrale, une pile d'images d'une région échantillon est enregistrée avec chaque image dans la pile surveillant une plage de longueurs d'onde différente, de sorte que les informations de l'ensemble de la pile révèlent le spectre de fluorescence émis pour chaque pixel d'image [10] . La boîte à outils d'imagerie spectrale est conçue pour le traitement par lots et les piles 3-4D. En utilisant la boîte à outils d'imagerie spectrale, nous avons pu traiter et analyser un ensemble de données contenant plus de 1500 cellules en quelques heures [3]. À notre connaissance, il s'agit de la plus grande étude utilisant le paramètre GP des membranes cellulaires comme mesure de l'ordre des lipides membranaires, soulignant l'utilité de notre boîte à outils. Pour un répertoire d'entrée de piles d'images spectrales, la boîte à outils d'imagerie spectrale génère des cartes GP pseudo-colorées, des histogrammes GP ajustés et des spectres tracés à l'ensemble de l'image, de l'objet entier et des niveaux de membrane segmentée pour chaque image du dossier, ainsi qu'un feuille de calcul résumant les résultats. Les images et métadonnées d'entrée sont automatiquement converties au standard de données OME-TIFF à l'aide de la bibliothèque de bio-formats (144 formats d'image actuellement pris en charge) [14]. Des options pour la reconstruction 3D automatique des empilements spectraux confocaux en Z [15] et la distribution des tailles tracées des vésicules sphériques sont également disponibles. Interface utilisateur graphique (GUI) Une interface utilisateur graphique (GUI) guide l'utilisateur à travers l'analyse de sorte qu'aucune compétence en programmation n'est requise. L'interface graphique a une conception à trois panneaux dans laquelle le panneau de gauche affiche les instructions et les éléments de menu, le panneau central permet la navigation à travers les images et l'interaction avec l'utilisateur (c'est-à-dire le recadrage et la sélection de la région d'intérêt), et le panneau de droite affiche une galerie d'images fournissant un aperçu des résultats. Le traitement permet une interaction utilisateur en trois étapes. Tout d'abord, l'utilisateur sélectionne les paramètres pour lesquels exécuter la boîte à outils d'imagerie spectrale, par exemple s'il faut inclure la segmentation de la membrane ou un facteur de correction GP. Ensuite, après la détection automatique des objets, l'utilisateur a la possibilité de segmenter davantage chaque objet détecté en utilisant une ou plusieurs routines de segmentation. Enfin, l'utilisateur peut consulter les résultats et supprimer les objets indésirables de l'analyse si nécessaire. Segmentation Les piles d'images spectrales sont seuillées à l'aide d'un seuil d'intensité déterminé automatiquement par la méthode d'Otsu [16]. Les objets d'intérêt sont ensuite segmentés et rognés en utilisant l'étiquetage des composants connectés du masque de seuillage binaire [17]. Les images recadrées résultantes sont affichées pour que l'utilisateur puisse éliminer les images recadrées hors cible si nécessaire. Si une image recadrée contient des objets connectés, tels que des GUV fusionnés ou des membranes cellulaires en contact, l'utilisateur peut facilement les séparer en utilisant une approche de segmentation par bassin versant. Avant de prendre la transformation du bassin versant qui identifie les objets comme des bassins versants séparés par des lignes de bassin versant [18], une série d'opérations sont menées pour améliorer les performances. A savoir, la transformée de distance du complément de l'image binarisée est calculée. La transformée de bassin versant de la transformée de distance annulée est ensuite prise. Ce processus est illustré sur la figure 1d. Par notre méthode, le niveau de seuil pour supprimer les minima peu profonds dans cette image est choisi de telle sorte que la transformation du bassin versant étiquette n objets pour la segmentation, où n est entré via l'interface graphique. En d'autres termes, si l'utilisateur spécifie qu'une image recadrée contient n cellules, n cellules sont segmentées. En raison de la sensibilité de cette méthode aux cellules de forme non convexe et aux variations d'intensité intracellulaire, l'utilisateur a également la possibilité de segmenter manuellement en utilisant la segmentation en lasso. En outre, la segmentation en lasso peut être utilisée pour effectuer une analyse spectrale sur toute région d'intérêt définie par l'utilisateur, y compris les vésicules intracellulaires. Fig. 1 La boîte à outils d'imagerie spectrale. a Une pile d'images spectrales auto-seuillées contenant des images d'émission de fluorescence C-Laurdan provenant de cellules A-549 marquées collectées à des longueurs d'onde allant de 410 à 528 nm. b La polarisation généralisée (GP) est ensuite calculée à chaque pixel en utilisant les intensités (I B et I R) des images collectées à λ B et λ R (à gauche) en utilisant l'équation (centre). Des cartes GP pseudo-colorées peuvent ensuite être générées (à droite, barre de couleur identique à la figure 2). La segmentation peut ensuite être effectuée sur les cartes GP à l'aide de la segmentation au lasso (c), où l'utilisateur dessine une région d'intérêt (ROI) (à gauche) utilisée pour générer un masque de segmentation (à droite). La segmentation peut également être effectuée en utilisant une approche basée sur les bassins versants (d). De gauche à droite en (d), la transformée de distance, la transformée de distance annulée et les composants étiquetés suivant la transformée du bassin versant. L'une ou l'autre routine de segmentation se traduira par les objets segmentés (e), à ​​partir desquels un nombre donné de pixels de bordure sont pris comme membranes segmentées (f) Étant donné que les images recadrées ne contiennent qu'un seul objet, la segmentation de la membrane est simple et fiable. Les objets des images recadrées binarisées sont remplis et les membranes détectées à l'aide de la détection des bords Sobel [19 - 21]. Les membranes sont ensuite segmentées à l'aide des pixels détectés sur les bords après dilatation avec un élément de ligne horizontale [22]. La boîte à outils d'imagerie spectrale possède également un mode objet sphérique conçu pour les microbulles et les vésicules sphériques, où les objets sont segmentés en trouvant des cercles à l'aide de la transformée de Hough circulaire [23, 24]. Polarisation généralisée (GP) Comme souligné précédemment, le paramètre GP est introduit pour la quantification du décalage spectral d'émission d'une sonde sensible à la polarité en raison de différences dans l'ordre des membranes lipidiques. La GP est généralement calculée en utilisant des intensités de fluorescence collectées à deux longueurs d'onde d'émission, λ B et λ R, se produisant respectivement aux maxima d'émission de la sonde dans une solution de référence ordonnée et désordonnée liquide [9, 10]. GP, qui varie de -1 à 1, est calculé pour chaque pixel de l'image spectrale à partir de l'équation suivante, $$ G P = \ frac {I_B- {I} _R} {I_B + {I} _R}, $$ (1) Où je B et moi R correspondent à l'intensité de fluorescence aux longueurs d'onde d'émission λ B et λ R, respectivement. Par conséquent, de faibles valeurs GP indiquent des environnements plus désordonnés. Pour clarifier, seules les intensités des images à λ B et λ R sont nécessaires pour le calcul GP, même avec des piles d'images spectrales constituées d'images collectées à de nombreuses longueurs d'onde (e. Fig. 1a). Ainsi, la pile d'images spectrales est réduite à deux images à λ B et λ R, et ces deux images sont réduites au paramètre GP à valeur unique à chaque pixel (figure 1b). Les valeurs GP calculées sont ensuite visualisées à l'aide d'une carte pseudo-colorée avec une table de correspondance mise à l'échelle de -1 à 1 [11]. Enfin, la distribution des valeurs GP est ajustée à une gaussienne à un ou deux pics choisie par l'erreur quadratique moyenne inférieure. L'histogramme GP résultant peut être utilisé pour calculer les changements dans l'ordre lipidique moyen ou, pour un gaussien à deux pics bien défini, pour indiquer la présence de deux phases [6]. Pour faciliter l'analyse spectrale supplémentaire, des spectres sont générés à partir des intensités moyennes des images à chaque longueur d'onde de la pile. Facteur de correction de polarisation généralisée (GP) La GP étant une mesure basée sur l'intensité, elle est fortement influencée par les paramètres du microscope, notamment le gain du détecteur et les paramètres du filtre. Lorsque GP est calculé en utilisant les intensités I B et I R de deux canaux détectant aux longueurs d'onde λ B et λ R, respectivement, les intensités relatives des deux canaux doivent être calibrées pour obtenir des valeurs absolues de GP. En acquérant une image d'une solution de référence avec le GP correspondant également mesuré avec un fluorimètre (GP ref), un facteur de correction, G, peut être introduit, $$ G = \ frac {I_ {B, \ ref} \ times \ left ( 1- G {P} _ {ref} \ right)} {I_ {R, \ ref} \ times \ left (1+ G {P} _ {ref} \ right)}, $$ (2) où I B, ref et I R, ref correspondent à l'intensité de fluorescence de l'image du microscope aux longueurs d'onde d'émission λ B et λ R, respectivement [25]. GP est ensuite calculé comme suit, $$ G P = \ frac {I_B- G \ times {I} _R} {I_B + G \ times {I} _R}. $$ (3) Dans la boîte à outils d'imagerie spectrale, la référence GP et une image de référence peuvent être spécifiées afin de déterminer G pour les calculs GP ultérieurs. Résultats Nous présentons ici plusieurs exemples de données d'imagerie spectrale traitées avec la boîte à outils d'imagerie spectrale. Imagerie spectrale par microscopie confocale L'imagerie spectrale a été réalisée sur un microscope confocal Zeiss LSM 780 équipé d'un réseau de détecteurs à 32 canaux en phosphure d'arséniure de gallium (GaAsP), comme indiqué précédemment [10]. Laurdan, C-Laurdan, FE et Di-4-ANEPPDHQ ont été excités à 405, 405, 488 et 488 nm respectivement et les plages de détection lambda définies entre 410 nm et 695 nm, 415 nm et 691 nm, 500 nm et 650 nm , et 490 nm et 695 nm respectivement. Les piles d'images spectrales résultantes ont été traitées et analysées à l'aide de la boîte à outils d'imagerie spectrale. Préparation des échantillons Des cellules A-549, des cellules épithéliales adénocarcinomiques alvéolaires humaines immortalisées, ont été cultivées dans des conditions de culture standard avec du milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Des vésicules unilamellaires géantes (GUV) faites de dioléoyl phosphatidylcholine (DOPC), de sphingomyéline cérébrale (cerveau SM) et de cholestérol d'Avanti Polar Lipids ont été produites dans un rapport molaire 2: 2: 1 par électroformation par une modification du protocole proposé par Angelova et Al. [10, 26]. Des microbulles à coque phospholipidique avec un rapport molaire 9: 1 de 1, 2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC, Avanti Polar Lipids, USA) et du polyoxyéthylène (40) stéarate (PEG40S, Sigma Aldrich, UK) ont été produites en utilisant un protocole de sonication par lots précédemment rapporté [27]. Les échantillons ont été marqués avec du C-Laurdan (400 nM pour les cellules A-549 et 100 nM pour les GUV et les microbulles) ou Di-4-AN (F) EPPTEA (FE) (100 nM pour les GUV) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ). Des vésicules géantes de membrane plasmique (GPMV) ont été isolées à partir de cellules de leucémie basophile de rat marquées avec 100 nM de Laurdan ou 100 nM de Di-4-ANEPPDHQ comme décrit par Sezgin et al. [28]. En bref, les cellules ont été exposées pendant 1 h à 37 ° C au tampon GPMV (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, pH 7,4) contenant 25 mM de paraformaldéhyde et 2 mM de dithiothréitol pour induire la vésiculation. Après la vésiculation, le surnageant riche en GPMV a été recueilli par pipetage et remis en suspension dans du tampon GPMV pour l'imagerie. Pour tous les échantillons, l'imagerie spectrale a été réalisée avec des échantillons sur des lamelles de verre de 170 μm d'épaisseur. Segmentation des cellules, des GUV et des microbulles La segmentation de l'image et l'analyse spectrale à l'aide de la boîte à outils d'imagerie spectrale sont illustrées à la figure 2. Cartes de polarisation généralisée (GP) pseudo-colorées, spectres de fluorescence générés à partir des intensités moyennes des images à chaque longueur d'onde du spectre une pile d'images et des histogrammes de valeurs GP équipés d'un gaussien à pic simple ou double sont fournis pour chaque exemple. L'analyse spectrale est démontrée avec des images de cellules colorées au C-Laurdan (Fig. 2a et c) et segmentées par la méthode des bassins versants (Fig. 2b) ou manuellement par lasso-segmentation (voir Fig. 2d). La valeur de la segmentation membranaire dans l'analyse spectrale est mise en évidence en comparant les spectres et les distributions GP des cellules segmentées sur les figures 2b et d avec les résultats de la pré-segmentation sur les figures 2a et c. Les spectres segmentés sont décalés vers le bleu et le GP a augmenté reflétant l'ordre lipidique supérieur des membranes cellulaires par rapport au milieu intracellulaire. Ceci est également indiqué par les distributions de GP gaussiennes à double pic dans les résultats de pré-segmentation sur les figures 2a et c. L'analyse spectrale est également démontrée avec des images de GUV composées d'un mélange de DOPC, de cerveau SM et de cholestérol (rapport molaire 2: 2: 1) marquées avec FE (Fig. 2e). La présence de DOPC, de SM cérébrale et de cholestérol donne clairement lieu à une séparation de phases comme indiqué par les pics distincts dans l'histogramme GP et dans la carte GP pseudo-colorée. La boîte à outils d'imagerie spectrale a été utilisée pour recadrer automatiquement les GUV fusionnés et supprimer les objets d'arrière-plan pour l'analyse spectrale. Dans ce cas, la segmentation de la membrane n'était pas nécessaire car l'intérieur des GUV n'était pas fluorescent comme dans les exemples avec cellules. La région d'ordre lipidique inférieur sur la carte GP (pixels bleus), cependant, est plus épaisse en raison de cette région ayant une intensité de fluorescence plus élevée. La segmentation de la membrane pourrait être utilisée pour effectuer un échantillonnage de pixels d'épaisseur égale autour du GUV, pour la cohérence de l'analyse à travers une population de plusieurs GUV. Les vésicules dérivées de membranes cellulaires (GPMV) et marquées avec Laurdan (Fig. 2g) ou Di-4-ANEPPDHQ (Fig. 2h) présentent également une séparation de phases comme indiqué par leurs cartes GP respectives. Les histogrammes GP des GUV et des GPMV illustrent une différence clé entre ces deux constructions. Les phases présentes dans les GPMV sont beaucoup plus proches dans l'ordre lipidique que celles présentes dans les GUV. L'analyse spectrale avec le mode de segmentation d'objet sphérique de la boîte à outils d'imagerie spectrale est illustrée sur la figure 2f avec une image de microbulles marquées au C-Laurdan. La segmentation automatisée d'une microbulle à partir d'un groupe de microbulles est démontrée. 2 Segmentation et analyse spectrale avec la boîte à outils d'imagerie spectrale. Chaque panneau contient de gauche à droite: une carte GP pseudo-colorée, les spectres calculés à partir de tous les pixels de la pile d'images spectrales avec des valeurs de signal significatives, et un histogramme des valeurs GP équipé d'un gaussien simple ou double pic. a Cellules A-549 colorées au C-Laurdan, marquant à la fois la membrane plasmique et le cytosol. Barre d'échelle 27 μm. b Les mêmes cellules de (a) mais maintenant segmentées en surface pour la membrane plasmique uniquement en utilisant la méthode des bassins versants. c Cellules A-549 colorées au C-Laurdan, marquant à la fois la membrane plasmique et le cytosol. Barre d'échelle 33 μm.d Les mêmes cellules de (c) mais maintenant segmentées en surface pour la membrane plasmique en utilisant uniquement la segmentation au lasso. En (b) et (d), les histogrammes et les spectres GP correspondent aux images indiquées par un astérisque. e GUV composés de DOPC, de SM du cerveau et de cholestérol (rapport molaire 2: 2: 1) marqués avec FE (Di-4-AN (F) EPPTEA). GUV non segmentées (extrême gauche), recadrées et isolées dans l'image adjacente. Barre d'échelle 17 μm. f L'image GP des microbulles marquées au C-Laurdan (à l'extrême gauche) a été auto-segmentée en utilisant le mode objet sphérique de la boîte à outils d'imagerie spectrale. Barre d'échelle 13 μm. L'une des microbulles, indiquée par la flèche dans l'image la plus à gauche, est représentée après la segmentation dans l'image adjacente. En raison du peu de pixels dans la microbulle segmentée, la distribution GP est affichée pour l'image non segmentée. g GPMV étiqueté avec Laurdan. Barre d'échelle 5 μm. h GPMV marqué avec Di-4-ANEPPDHQ. La légende de la barre de couleur donne des valeurs GP et est valable pour toutes les images Reconstruction 3D de cartes GP pseudo-colorées Une reconstruction 3D de valeurs GP pseudo-colorées calculées à partir d'une pile z spectrale de GUV marqués FE est illustrée sur la figure 3. Une seule tranche de la pile peut être vue sur la figure 2e. Les deux GUV séparés en phase au premier plan sont connectés à leur extrémité inférieure par le biais de domaines plus ordonnés lipidiques (GP <0). 3 Image GP reconstruite 3D calculée à partir d'une pile d'images spectrales de GUV marqués FE à l'aide de la boîte à outils d'imagerie spectrale. Les axes donnent des dimensions spatiales le long des trois dimensions et la légende de la barre de couleur indique les valeurs GP Distribution de la taille des microbulles Dix piles d'images spectrales de microbulles DSPC-PEG à rapport molaire 9: 1 marquées au C-Laurdan ont été analysées avec le mode de segmentation d'objets sphériques de la Spectral Imaging Toolbox. Les cartes GP pseudo-colorées résultantes, la distribution de taille des microbulles segmentées (n = 71) et la distribution des valeurs moyennes de GP pour les microbulles segmentées (n = 71) sont affichées sur la figure 4. 4 Analyse spectrale et distribution de taille des microbulles. a Images GP pseudo-colorées de 10 piles d'images spectrales de microbulles marquées au C-Laurdan. Les microbulles ont été auto-segmentées et analysées en utilisant le mode objet sphérique de la boîte à outils d'imagerie spectrale. Barre d'échelle 30 μm. La légende de la barre de couleur donne les valeurs GP. b Distribution granulométrique (diamètre) des microbulles segmentées (n = 71). c Distribution des valeurs moyennes de GP pour les microbulles segmentées (n = 71) Discussion Aspects nouveaux La boîte à outils d'imagerie spectrale est le premier logiciel gratuit et open-source à mesurer avec précision le remplissage lipidique de la membrane cellulaire sans contributions cytosoliques à l'aide d'un seul colorant. De plus, en mettant en œuvre le traitement par lots et hyperstack ainsi que la reconstruction 3D de piles z confocales, il répond à un besoin croissant de traiter de grands ensembles de données d'imagerie spectrale et des données d'expériences à expositions multiples. C'est également le seul logiciel d'imagerie spectrale à notre connaissance à exploiter respectivement différentes routines de traitement pour les vésicules, pour les cellules adhérentes et pour les régions d'intérêt (c'est-à-dire sous-cellulaire). Enfin, si les algorithmes utilisés ne sont pas individuellement nouveaux, leur implémentation en imagerie spectrale n'est pas disponible ailleurs à notre connaissance. Comparaison avec les logiciels existants Sans utiliser la segmentation membranaire, il est courant de décomposer l'histogramme GP en deux composants gaussiens, le composant GP inférieur correspondant principalement aux régions intracellulaires et le composant GP supérieur à la membrane cellulaire [29]. Bien que cette technique soit utile pour localiser des régions d'ordre lipidique élevé et faible, elle n'est pas appropriée pour déterminer l'ordre lipidique de la membrane plasmique. Les domaines d'ordre lipidique faible dans la membrane et les vésicules d'ordre lipidique élevé à l'intérieur de la cellule, par exemple, ne pouvaient pas être attribués à leurs composants sous-cellulaires respectifs sans une certaine forme de segmentation. Ainsi, un logiciel plus avancé est nécessaire pour déterminer avec précision l'ordre des lipides membranaires. Les outils existants pour le traitement des données d'imagerie spectrale avec le paramètre GP incluent les plugins ImageJ de Sezgin et al. et Owen et al., et SimFCS développé par le professeur Enrico Gratton [10, 30, 31]. Ces outils fournissent tous des moyens adéquats pour calculer la GP, générer des visualisations GP et des histogrammes pour une seule image spectrale. Le plugin d'Owen et al. fournit un traitement par lots et permet la segmentation de la membrane avec la nécessité d'une acquisition d'image secondaire et d'une étiquette de membrane fluorescente. La boîte à outils d'imagerie spectrale ne nécessite pas d'étiquette de membrane supplémentaire ni d'étape d'acquisition d'image pour réaliser la segmentation de la membrane. Sezgin et al. permettent d'ajuster les spectres de chaque pixel avec une fonction gaussienne ou gamma-variable pour interpoler les intensités, I B et I R, pour réduire le bruit dans le calcul GP. Nous avons constaté que l'ajustement de la variation gamma est le plus approprié pour les données d'imagerie spectrale mais était trop coûteux en calcul pour le traitement par lots et par hyperstack. La boîte à outils d'imagerie spectrale permet à la place de lisser éventuellement les images d'intensité à l'aide d'un filtre médian avant le calcul GP, un peu comme SimFCS. La puissance de SimFCS est sa capacité à traiter de nombreux types de données d'imagerie avancées avec une seule suite logicielle. Cependant, SimFCS ne prend pas en charge le traitement par lots, la segmentation du retour sur investissement, la segmentation de la membrane ou l'analyse et la visualisation GP z-stack - les principales caractéristiques de la Spectral Imaging Toolbox. En ce qui concerne la disponibilité, ImageJ est gratuit [32], tout comme SimFCS 2 de Globals Software (bien que la licence de laboratoire pour la version mise à jour, SimFCS 4, soit 2000 $). La plupart des institutions de recherche ont des licences MATLAB et sans licence de site, les étudiants peuvent acheter MATLAB avec les modules complémentaires nécessaires pour seulement 60 $. Un autre avantage de notre logiciel est la facilité de personnalisation. SimFCS n'est pas conçu pour la modification par l'utilisateur du code source, et ImageJ ne fournit qu'un langage de macro limité et une fonction de plugin. Inversement, la boîte à outils d'imagerie spectrale peut être facilement étendue à l'aide d'opérations vectorielles MATLAB bien adaptées au traitement et à l'analyse d'images rapides et complexes. Le code open-source sera conservé sur le Central File Exchange de MATLAB à l'URL fournie où les mises à jour et les demandes de fonctionnalités peuvent être discutées publiquement. Conclusion La boîte à outils d'imagerie spectrale offre un moyen facile à utiliser d'analyser de grands ensembles de données d'imagerie spectrale. Il ne nécessite aucune expérience en programmation, produit des chiffres de qualité publication, permet une segmentation fiable de la membrane sans avoir besoin d'un contre-colorant et intègre un traitement par lots et hyperstack. Il est de notre intention de continuer à développer cette boîte à outils gratuite et open-source avec la contribution de la communauté pour faciliter davantage les recherches ambitieuses avec l'imagerie spectrale. Disponibilité et exigences Nom du projet: page Web du projet Spectral Imaging Toolbox: Système d'exploitation: testé sur Windows 7 Langage de programmation: MATLAB 2015+ Autres exigences: Boîte à outils de traitement d'image Licence: GPL Toute restriction d'utilisation par des non-universitaires: aucune Références 1. Lingwood D, radeaux Simons K. Lipid comme principe d'organisation de la membrane. 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Télécharger les références Remerciements Nous tenons à exprimer notre gratitude au Dr Shamit Shrivastava et Valerio Pereno pour des discussions utiles, James Fisk et David Salisbury pour la fabrication de l'appareil, et Falk Schneider pour l'aide à la préparation des GUV. Le financement Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherche en génie et sciences physiques (EPSRC, numéro de subvention EP / I021795 / 1) qui a financé le matériel de recherche et le projet global dont ce travail fait partie. Miles Aron remercie chaleureusement l'Institut de l'ingénierie et de la technologie pour son soutien financier à sa bourse de doctorat. JBdlS reconnaît le soutien d'une subvention d'intégration de carrière Marie Curie. CE, JBdlS et ES reconnaissent le soutien du microscope par le Centre d'imagerie Wolfson et le soutien financier de la Fondation Wolfson, le Medical Research Council (MRC, numéro de subvention MC_UU_12010 / programmes unitaires G0902418 et MC_UU_12025), MRC / BBSRC / EPSRC (numéro de subvention MR / K01577X / 1) et Wellcome Trust (subvention réf. 104924/14 / Z / 14). Aucun des organismes de financement n'a joué un rôle dans la conception de l'étude, dans la collecte, l'analyse et l'interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit. Disponibilité des données et des matériaux Les ensembles de données traités dans cette étude sont fournis avec le logiciel avec des instructions à des fins de démonstration. Contributions des auteurs MA et RB ont écrit et implémenté le logiciel. MA a rédigé le manuscrit. MA et DC ont effectué les mesures avec des cellules. DC, ES et JBdlS ont effectué les mesures avec des GUV. RB a réalisé les expériences avec des microbulles. CE et ES ont supervisé et participé à la conception du projet. Tous les auteurs ont participé à la révision du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final. Intérêts concurrents Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent. Consentement à la publication N'est pas applicable. Approbation éthique et consentement à participer Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les réclamations juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles. Informations sur l'auteur Affiliations Department of Engineering Science, Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford, Oxford, OX3 7DQ, UK Miles Aron, Richard Browning, Dario Carugo & Eleanor Stride Faculty of Engineering and The Environment, University of Southampton, Southampton, SO17 1BJ, Royaume-Uni Dario Carugo MRC Human Immunology Unit, Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford, Headley Way, Oxford, OX3 9DS, UK Erdinc Sezgin, Jorge Bernardino de la Serna & Christian Eggeling Research Complex at Harwell, Central Laser Facility, Rutherford Appleton Laboratory , Science and Technology Facilities Council, Harwell-Oxford, OX11 0FA, Royaume-Uni Jorge Bernardino de la Serna Auteurs Rechercher Miles Aron dans: Rechercher Richard Browning dans: Rechercher Dario Carugo dans: Rechercher Erdinc Sezgin dans: Rechercher Jorge Bernardino de la Serna dans: Rechercher Christian Eggeling dans: Rechercher Eleanor Stride dans: Auteur correspondant Correspondance avec Eleanor Stride. Droits et autorisations Libre accès Cet article est distribué sous les termes de Creative Commons Attribution 4. 0 Licence internationale (), qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que vous accordiez le crédit approprié aux auteurs originaux et à la source. , fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. La dérogation Creative Commons Public Domain Dedication () s'applique aux données mises à disposition dans cet article, sauf indication contraire. Réimpressions et autorisations À propos de cet article Citez cet article Aron, M., Browning, R., Carugo, D. et al. Boîte à outils d'imagerie spectrale: segmentation, reconstruction d'hyperstack et traitement par lots d'images spectrales pour la détermination de l'ordre des lipides des cellules et des membranes modèles. BMC Bioinformatics 18, 254 (2017). Télécharger la citation Reçu: 26 novembre 2016 Accepté: 26 avril 2017 Publié: 12 mai 2017 DOI: Mots clés Imagerie spectrale Ordre lipidique Emballage lipidique Viscosité de la membrane Segmentation de la membrane Laurdan.

S'identifier Boutique Communauté Soutien Changer de langue Afficher le site Web du bureau Hyperstacks Hyperstacks est un jeu d'action frénétique "shoot 'em up" qui propose du parkour et des puzzles en VR. Parkour, puzzles, lasers, scies, ennemis, balles, vous êtes prêt pour le plaisir? Tous les avis: Aucun avis d'utilisateur Connectez-vous pour ajouter cet article à votre liste de souhaits, suivez-le ou marquez-le comme non intéressé Obtenez un accès instantané et commencez à jouer; s'impliquer dans ce jeu au fur et à mesure qu'il se développe. Remarque: ce jeu d'accès anticipé n'est pas terminé et peut ou ne peut pas changer davantage. Si vous n'êtes pas excité de jouer à ce jeu dans son état actuel, alors vous devrait attendre de voir si le jeu progresse davantage dans le développement. Apprendre encore plus Ce que les développeurs ont à dire: «Parce que l'état de développement du jeu est très précoce nous aimerions recevoir tous les commentaires possibles des utilisateurs et ainsi pouvoir écouter la communauté pour améliorer le jeu. " «Il serait trop tôt pour dire une date mais environ un an. " "Nous intégrerons un atelier sur le contenu communautaire, coopérative et compétitive en ligne, Les graphismes et la conception globale du jeu vont changer pour le mieux, sans aucun doute. Nous aurons un éditeur de niveau en jeu, puissant et facile à utiliser avec lequel vous pouvez défier vos amis de passer cette nouvelle carte chaotique que vous allez créer. " "Vous pouvez obtenir plus d'informations sur l'état actuel du jeu dans la section" À propos de ce jeu " mais nous travaillons toujours sur l'éditeur de niveau et le mode coopératif, en plus, nous continuons à peaufiner toutes les fonctionnalités » «Lors de l'accès anticipé, le prix sera un peu plus bas afin de compenser les utilisateurs qui croient en nous et nous soutiendront lors du développement de l'accès anticipé du jeu. " «Permettre à la communauté de créer des articles où elle peut donner des idées, des commentaires et des questions sur le jeu. De plus, le jeu sera fait par et pour les joueurs, car une grande partie des armes et des niveaux seront fabriqués par la communauté elle-même et ils sont remerciés à l'intérieur du jeu. " Lire la suite Remarquer: Nécessite un casque de réalité virtuelle. Voir la section Support VR pour plus d'informations. Ce jeu n'est pas encore disponible sur Steam Rejoignez notre communauté discord En rejoignant notre communauté discord, vous pourrez accéder gratuitement aux premières démos de test avant la sortie de vapeur Qu'attendez-vous ?, Rejoignez-nous et invitez vos amis À propos de ce jeu Hyperstacks est un jeu roguelike VR avec parkour et un tableau de puzzles. Plongez-vous dans cette réalité de test et ne vous arrêtez jamais de contester. Combattez les ennemis, escaladez les murs, résolvez des énigmes et esquivez tout comme le danger. C'est Hyperstacks! Caractéristiques Pas de points de contrôle - Vous mourrez, vous revenez au début, il n'y a pas d'espace de "sauvegarde". Mourir est amusant - Chaque mort vous récompense d'une manière spéciale. Community Based - Jouez avec les armes que la communauté a fabriquées, survivez aux niveaux de votre voisin. Combat au corps à corps et à distance - Écrasez vos ennemis avec votre propre style de combat! Mouvement VR complet - Déplacez n'importe quelle direction, même vers le haut ou vers le bas. Pièges mortels - Juste ... ne touchez rien au rose. Boss épiques - Combattez contre une grande variété de boss qui feront de votre vie un enfer. Mini-jeux - Obtenez des scores plus élevés que vos amis et montrez-leur que vous rockez. Éditeur de niveaux - Créez des niveaux mortels en VR pour voir comment les joueurs souffrent. Configuration requise Minimum: OS: Windows 7 Processeur: Intel i5 Mémoire: 8 Go de RAM Graphiques: GTX 970 DirectX: Version 10 Réseau: Connexion Internet haut débit Stockage: 1200 Mo d'espace disponible Recommandé: OS: Processeur: Graphiques: Réseau: Connexion Internet haut débit Il n'y a aucune critique sur ce produit Vous pouvez écrire votre propre avis sur ce produit pour partager votre expérience avec la communauté. Utilisez la zone au-dessus des boutons d'achat sur cette page pour rédiger votre avis.

Modifié: 2020-03-02T21: 04: 59.3821954 + 11: 00. Abonnement Packt | Apprenez plus pour moins. Youtube. Nous utilisons des cookies pour vous offrir une meilleure expérience, personnaliser le contenu, personnaliser la publicité, fournir des fonctionnalités de médias sociaux et mieux comprendre l'utilisation de nos services. Pour en savoir plus ou modifier / empêcher l'utilisation de cookies, consultez notre politique en matière de cookies et notre politique de confidentialité. J'ai une pile z d'un canal et une pile z séparée à 3 canaux. Je voudrais les fusionner pour obtenir une image à 4 canaux, avec les trois canaux d'une pile et le quatrième de l'autre pile. Je devrais m'assurer que chaque image correspond en termes d'emplacement z (donc l'image 1 du canal 1 correspond à l'image 1 de tous les autres canaux). Des idées? Merci Stack Manipulation - ImageJ University of Connecticut Tant que les fichiers de la pile ont les mêmes dimensions, la profondeur de bits et les plans z correspondent entre les fichiers, je ferais ceci: Tout d'abord, divisez les trois canaux en piles individuelles (Image-Color-Split Canaux) pour que vous les ayez en plus de la quatrième pile de canaux. Ensuite, recombinez les quatre (canaux de fusion d'image-couleur). Chris University of Connecticut Tant que les fichiers de pile sont de mêmes dimensions, profondeur de bits et que les plans z correspondent entre les fichiers, je ferais ceci: Tout d'abord, divisez les trois canaux en piles individuelles (Image-Color-Split Channels) afin que vous avoir ceux plus la quatrième pile de canaux. Chris Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg Christopher a raison, pouce en l'air. Si vous utilisez une version antérieure d'ImageJ, il se peut que vous n'ayez pas beaucoup d'options dans le menu Image-> Couleur -> fusionner les canaux. Vous devez mettre à jour ou utiliser l'un des plugins. Pour toutes les autres manipulations de pile, c'est une excellente ressource. Meilleur Soenke Pontificia Universidad Católica de Chile Salut! Vous pouvez peut-être aussi essayer de concaténer les piles en utilisant: Image> Piles> Outils> Concaténer ... Bonne chance! : D National Yang Ming University le suivant la macro de fusion par lots pour deux canaux. vous pouvez ajouter deux canaux supplémentaires en macro pour obtenir des piles d'images à 4 canaux. input = getDirectory ("Choisissez un répertoire d'entrée"); output = getDirectory ("Choisissez un répertoire de sortie"); processFolder (entrée); function processFolder (dir) {list = getFileList (dir); for (i = 0; i <; i ++) {if (endsWith (list [i], "")) {// ajouter le fichier se terminant pour vos images processFile (dir, output, list [i]);} else if (endsWith (list [i], "/") &&! matches (output, ". *" + substring (list [i], 0, lengthOf (list [i]) - 1) + ". *")) { // si le fichier rencontré est un sous-dossier, allez à l'intérieur et exécutez l'ensemble du processus dans le sous-dossier processFolder ("" + dir + list [i]);} else {// si le fichier rencontré n'est pas une image ni un dossier juste affiche le nom dans la fenêtre du journal print (dir + list [i]);}}} function processFile (inputFolder, output, file) {open (inputFolder + file); title = getTitle (); run ("Split Channels"); deux = "C2-" + titre; un = "C1-" + titre; selectWindow ("C1 -" + titre); selectWindow ("C2 -" + titre); run ("Merge Channels ...", "c1 = [" + one + "] c2 = [" + two + "]"); saveAs ("tiff", sortie + fichier); fermer (fichier);} University College London Bonjour, j'ai besoin d'aide pour superposer une image confocale (l'image a 42 z-stack) pour obtenir une projection complète de mes cellules sur un échafaudage 3D poreux. La projection maximale n'a pas aidé. Université nationale Yang Ming Vous pouvez utiliser la visionneuse imagej 3D pour obtenir une image 3D pivotée librement. Ou, utilisez la vue orthogonale pour obtenir des vues projetées xz et yz, utilisez image> pile et modifiez les images en pile, puis utilisez image> Hyperstack> Mesure automatique du seuil Otsu à l'aide d'ImageJ. Vous ne trouvez pas les bonnes réponses sur Google? Inscrivez-vous aujourd'hui pour rejoindre notre réseau de plus de 15 millions de professionnels scientifiques.
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Histoire le livre d'armagh est inextricablement lié à patrick, et c'est des livres d'histoire hyperstack sans erreur. Cela montre que c'était son propre livre et que le saint patron de l'Irlande était donc spirituellement, et de toute autre manière, lié à armagh. Ouvre une boîte de dialogue pour sélectionner un fichier xmp, chargeant ainsi une pile d'historique que vous pouvez coller sur les images. Les fichiers qui ont été exportés par darktable contiennent généralement la pile d'historique complète si le format de fichier prend en charge les métadonnées intégrées (voir la section 2. 12, «Exporter sélectionné» à propos de cette fonctionnalité de livres d'historique d'hyperstack et de ses limites). Articles divers 20/3 dans l'encyclopédie des micro-ordinateurs - volume 3, pages 360 à 362 [236]. 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Options de configuration. Il s'agit de livres d'histoire d'hyperstack disponibles auprès de lexikon services, 3241 boulder creek way, antelope, california, ca 95842. La famille de vaisseaux de culture cellulaire hyperstack hyperstack history books a été développée comme un système modulaire, avec le vaisseau hyperstack-12 comme module unique. Ces modules peuvent être empilés, permettant au processus d'être mis à l'échelle selon les besoins de la fabrication. L'histoire de l'hyperstack réserve l'hyperstack. C'est de la fiction historique plutôt que de l'histoire. Néanmoins, tous les efforts ont été faits pour que les livres d'histoire soient empilés afin d'éviter de violer tout fait historique connu. Tout comme les bibliothèques pour la préservation et la disponibilité des livres et des revues. Les ressources hyperstack sont bien définies et créées selon les normes de texte actuelles. 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Corning incorpore (nyse: glw) les livres d'histoire des hyperstacks ont annoncé aujourd'hui la disponibilité du récipient de culture cellulaire corning® hyperstack ™ pour une croissance cellulaire à haut rendement. Le vaisseau hyperstack présente une conception multicouche unique basée sur la technologie des livres d’hyperstack à film perméable au gaz et fournit plus de 2,5 fois l’historique d’hyperstack livre plus de cellules dans la même empreinte volumétrique que les produits actuels à plaques empilées. Développement de l'histoire. Hypercard a été créé par Bill Atkinson à la suite d'un voyage lsd. Les travaux ont commencé en mars 1985 sous le nom de wildcard (d'où son code créateur de wild). En 1986, dan winkler a commencé à travailler sur l'hypertalk et le nom a été changé en hypercard pour des raisons de marque. Il a été initialement publié en août 1987, avec l'accord. 1000 événements qui ont changé le monde 13. Il y a 79 milliards d'années, un très petit endroit avec une densité infinie explose créant l'univers à une température si élevée que les quatre forces fondamentales - électromagnétisme, gravitation, faible interaction nucléaire et forte interaction nucléaire - sont toutes unifiées dans une force fondamentale. Les piles virtuelles sont en lecture seule, donc les modifications apportées aux données de pixels ne sont pas enregistrées lorsque vous passez à une autre tranche. Vous pouvez contourner cela en utilisant des macros (par exemple, traiter la pile virtuelle) ou la pile virtuelle de traitement par lots. ↓ commande, vous pouvez facilement manquer de mémoire en utilisant des commandes telles que recadrage d'image [x] ↓ car toute pile générée à partir de commandes qui ne génèrent pas de piles virtuelles le sera.

 

Publié: 2020-03-17T05: 00: 48.4435750 + 10: 00. Vanished VPN est un service VPN basé en Australie qui est idéal pour ceux qui cherchent à accéder à de nombreux contenus Netflix, en particulier ceux qui souhaitent accéder aux bibliothèques Netflix. Leur solution de contournement de signature vous permet de diffuser des tonnes de contenu autrement indisponible en utilisant l'un de leurs serveurs proxy sécurisés. Avec Vanished VPN, vous pouvez facilement configurer plusieurs serveurs, chacun pouvant être utilisé pour accéder au contenu d'un pays différent (par exemple, un serveur pour le contenu canadien Netflix, un pour le contenu asiatique, etc.). L'inscription et la configuration ne sont pas aussi faciles avec Vanished VPN qu'avec d'autres VPN. Étant donné que Vanished n'a pas d'applications configurées, vous devez configurer manuellement vos connexions VPN et vous devez également attendre qu'un e-mail arrive avec votre nom d'utilisateur et votre mot de passe. Cependant, ils valent la peine d'être essayés car vous disposez d'une fenêtre de trois jours pour les vérifier, et ils sont relativement peu coûteux après cela. À des vitesses aussi faibles que 1 Mbps, Vanished est loin d'être le meilleur VPN gratuit du marché, mais il est également loin d'être le pire. Vous pourrez diffuser du contenu à partir de nombreux réseaux pendant votre essai gratuit, et ils ne conserveront aucun journal de votre activité utilisateur. Caractéristiques: compatibilité multi-appareils (Mac, Windows, OSX, Android, Playstation 4), optimisation des géoblocs, plans abordables, pas de journaux Le site Web plutôt nu de VPN disparu offre très peu d'informations sur leur plan gratuit, au lieu de vous attirer avec le mystère de l'essayer. En tant que startup, ils ne sont pas le VPN le plus sûr du marché. En fait, en cas de problème, les utilisateurs sont en fait tenus pour responsables et aucun numéro de téléphone n'est répertorié sur leur site (généralement le signe d'une opération louche). Un autre facteur discutable est leur politique de journalisation. Bien que Vanished VPN prétende ne pas enregistrer ou vendre de données utilisateur, il enregistre votre adresse IP source, les heures de début et de fin de connexion et le nombre total d'octets que vous utilisez pendant 30 jours. Cela aurait été fait dans le but de dépanner, de facturer et de gérer tout crime commis au cours de leur service. Une fois le délai de 30 jours écoulé, ces informations seraient effacées, mais il nous est impossible de savoir si c'est vraiment ce qui se passe. Oui, MAIS avec une forte mise en garde. Pour les utilisateurs très basiques qui ont besoin d'anonymat à court terme tout en effectuant une navigation occasionnelle, Vanished VPN peut vous convenir. Si vous êtes comme le reste d'entre nous qui passent beaucoup de temps en ligne et ont besoin d'un hôte dédié avec un cryptage solide et une réputation établie parmi la communauté VPN, ce n'est pas la solution VPN dont vous avez besoin.

Accueil VPN (Crédit d'image: Future) Nous aimons tous un billet de faveur, et il n'est donc pas surprenant que les VPN gratuits soient devenus si massivement populaires au cours des dernières années. Surtout lorsque vous considérez que l'installation de l'un des meilleurs services VPN donne à votre PC Windows, Mac, appareil Android ou iPhone une couche de sécurité supplémentaire. La sécurité étanche est très bien, mais c'est la fonctionnalité supplémentaire que leur nature de changement d'URL donne - regarder les sports et la télévision dans d'autres pays, contourner les sites Web géo-bloqués, torrent anonyme - cela signifie qu'il n'y a pas de surprise que les services VPN gratuits soient devenus si très recherché. Et sur cette page, vous trouverez notre sélection des meilleures options VPN gratuites disponibles en téléchargement aujourd'hui. Nous avons testé et retesté des dizaines d'entre eux et évalué leur capacité à garder votre activité en ligne sûre et anonyme sans que vous ayez à dépenser un centime. Le meilleur VPN gratuit pour le moment est Hotspot Shield Free. Nous aimons vraiment le fait que - malgré le fait que ce soit un cadeau - vous bénéficiez toujours d'une couverture pour cinq appareils en même temps à partir d'un seul compte. La limite d'utilisation des données est également plus généreuse que les autres packages. Mais (il y en a toujours un), est-il vraiment possible d'obtenir un bon VPN entièrement gratuit qui fait le travail dont vous avez besoin? La réponse est ... en quelque sorte. En fin de compte, si vous recherchez un VPN gratuit pour une utilisation occasionnelle, vous trouverez quelque chose qui répond à vos besoins - tant que vous êtes satisfait des limitations que les VPN gratuits comportent généralement. Et avant de rester coincé dans notre liste des meilleurs VPN gratuits, il vaut la peine de savoir qu'une version payante peut coûter aussi peu que 3 $ par mois et peut vous offrir de bien meilleures performances et protection, nous vous recommandons donc de consulter le aussi la meilleure page de service VPN globale. N'oubliez pas: les VPN gratuits peuvent ne rien coûter, mais il y a généralement une bonne raison à cela - il se peut que le fournisseur réalise un profit avec de la publicité invasive ou, dans certains cas, en vendant des données à des tiers (plutôt en battant le lecteur entier pour la vie privée en premier lieu). Le meilleur VPN au monde en ce moment est: ExpressVPN Nous avons examiné plus d'une centaine de fournisseurs VPN, gratuits et payants, et notre principale recommandation en ce moment est ExpressVPN. En effet, bien qu'il s'agisse d'une option payante, sa vitesse et sa robustesse ainsi que les serveurs qu'il possède dans près de 100 pays à travers le monde et peuvent accueillir presque tous vos appareils. Ce n'est pas gratuit, mais il vient avec une garantie de remboursement de 30 jours sans aucun problème et nous vous recommandons fortement de l'essayer sur toutes les options gratuites - plus si vous utilisez le lien suivant, vous pouvez réclamer 3 mois gratuits avec un plan annuel! Consultez notre guide du meilleur VPN de 2020 aux États-Unis? Ce sont les meilleurs VPN américains Économisez de l'argent avec les meilleures offres VPN d'aujourd'hui Le meilleur VPN gratuit pour 2020: Hotspot Shield Free est extrêmement facile à utiliser et offre une allocation de données généreuse 1. Hotspot Shield Free VPN Notre VPN gratuit n ° 1 Nombre de serveurs: 2, 500 | Emplacements des serveurs: 70+ | Adresses IP: N / A | Nombre maximal d'appareils pris en charge: 5 Allocation de données quotidienne de 500 Mo facile à utiliser Les performances axées sur la sécurité peuvent souffrir un peu La configuration est un peu compliquée Non seulement Hotspot Shield Free est l'une des options VPN gratuites les plus connues de notre classement, mais nous estimons également que c'est le meilleur. Vous pouvez choisir de vous ancrer dans l'un des 70 pays si vous payez pour la version Elite de Hotspot, et cela devrait vous permettre d'accéder à tout ce que vous voulez; dans la version gratuite, vous êtes limité aux emplacements que Hotspot Shield choisit pour vous et affichez des publicités. Ceux qui bénéficient du forfait gratuit peuvent protéger jusqu'à cinq appareils simultanément et sont limités à 500 Mo de données par jour (soit environ 15 Go par mois). Cela peut sembler restrictif, mais par rapport à TunnelBear ci-dessous, c'est en fait l'une des limites VPN gratuites les plus généreuses. Si la sécurité est votre seul objectif, Hotspot est sur la même longueur d'onde, avec un `` cryptage de qualité militaire '' - réconfortant si vous effectuez vos opérations bancaires et vos achats en ligne ou par mobile. En plus de la sécurité, Hotspot Shield Free a également remporté des applaudissements lors de nos tests pour sa convivialité. Que ce soit sur sa version mobile ou sur ordinateur de bureau, vous ne trouverez pas l'expérience utilisateur époustouflante offerte par certains concurrents. Cela dit, le démarrage est un peu pénible avec Hotspot qui vous oblige à passer par un essai de sept jours de la version premium en premier. C'est très bien, mais cela implique de leur donner les détails de votre carte de crédit au cas où vous décidez de continuer avec la version complète une fois l'essai terminé. Cependant, vous pouvez bien sûr opter pour la version gratuite une fois l'essai premium expiré. Vous voulez essayer Hotspot Shield Free? Vous pouvez le télécharger ici Si vous êtes nouveau dans le monde des réseaux privés virtuels ou si vous êtes tout simplement satisfait qu'un VPN gratuit soit suffisant pour vos besoins, alors télécharger et installer Hotspot Shield sans frais est vraiment facile à faire. Et cela ne vous empêche pas de mettre à niveau ou d'aller chez un autre fournisseur quand vous le souhaitez. View Deal TunnelBear est incroyablement simple à utiliser - il suffit de l'allumer et de choisir un emplacement, et votre trafic Internet sera réacheminé via ce nœud (Crédit d'image: Tunnelbear) 2.TunnelBear Protéger votre identité n'est pas plus simple que cela - TunnelBear est le meilleur VPN gratuit que vous pouvez télécharger aujourd'hui Nombre de serveurs: 1 000 | Emplacements des serveurs: 20+ | Adresses IP: N / A | Nombre maximum d'appareils pris en charge: 5 Vraiment convivial Clients mobiles et de bureau Peu d'options ou de paramètres Faible limite de données TunnelBear pourrait avoir quelque chose d'une conception moche, mais c'est un VPN gratuit sérieux, surtout après son acquisition par le géant de la sécurité, McAfee. Il existe des abonnements gratuits et payants. La seule restriction avec le plan gratuit est que vous êtes limité à 500 Mo de trafic chaque mois. Ce n'est pas énorme, vous ne pourrez donc pas utiliser TunnelBear tout le temps sans payer, mais c'est génial lorsque vous avez besoin d'une protection supplémentaire et que vous souhaitez emprunter la route gratuite VPN . TunnelBear propose une gamme de plans payants qui suppriment les restrictions associées au plan gratuit, comme la limite de téléchargement, le nombre de pays disponibles et le nombre d'appareils connectés. TechRadar a obtenu un accord exclusif de TunnelBear qui vous donne tout cela pour aussi peu que 4 $. 99 par mois, c'est une économie énorme de 58%. Il est également intéressant de noter que TunnelBear a récemment optimisé sa politique de confidentialité, de sorte que le VPN collecte désormais encore moins de données sur les utilisateurs - supprimant la nécessité de fournir un prénom pour vous inscrire et abandonnant son enregistrement du nombre total de connexions de l'utilisateur pour la durée de vie. Vous voulez obtenir TunnelBear gratuitement? Vous pouvez le télécharger ici Achetez TunnelBear Premium pour aussi peu que 4 $. 99 par mois Windscribe est un nouveau nom sur le bloc, mais son plafond de données et l'accent mis sur la confidentialité en font un gagnant 3. Windscribe Super sécurisé, avec un plafond de données très généreux, Windscribe est un VPN gratuit de premier ordre Nombre de serveurs: 400 + | Emplacements des serveurs: 60+ | Adresses IP: N / A | Nombre maximal d'appareils pris en charge: 10 Go de données par mois illimitées Politique de confidentialité de Sterling Les vitesses sont parfois incohérentes Windscribe est un nouveau venu sur la scène VPN gratuite, mais sa généreuse allocation de données et son engagement à protéger votre vie privée en font le meilleur si vous avez besoin de plus de données que le niveau gratuit de 500 Mo avec TunnelBear. Vous bénéficiez de 10 Go de bande passante par mois en standard et pouvez choisir parmi dix emplacements de serveurs distants avec le VPN Windscribe gratuit, y compris le Royaume-Uni, Hong Kong, le Canada et le VPN américain). Il vous suffit de créer un nom d'utilisateur et un mot de passe pour vous inscrire (une adresse e-mail est facultative, mais peut s'avérer utile si vous oubliez votre mot de passe). Windscribe ne stocke pas les journaux de connexion, les tampons IP ou les sites visités; lorsque vous êtes activement connecté à un serveur, il stocke votre nom d'utilisateur, le serveur VPN auquel vous êtes connecté et la quantité de données transférées, mais cela est effacé dans les trois minutes suivant la fin de la session. En tweetant sur le fournisseur, vous gagnerez 5 Go supplémentaires et vous obtiendrez 1 Go chaque fois que vous invitez un ami à vous rejoindre. Comme avantage supplémentaire, si quelqu'un que vous avez parrainé décide de passer à un abonnement Pro (à partir d'environ 4 $ par mois facturé annuellement), vous obtiendrez également le plan illimité et bien plus de serveurs (60+ au total). Si cela ne suffit pas pour vous tenter, il y a même un adblocker et un pare-feu intégrés. Vous voulez essayer Windscribe? Vous pouvez le télécharger ici Speedify est le «Top Gun» des VPN gratuits, répondant à votre besoin de vitesse 4. Speedify Vous voulez une connexion sécurisée mais rapide? Alors ne cherchez plus. Nombre de serveurs: 200+ | Emplacements des serveurs: 50+ | Adresses IP: N / A | Nombre maximum d'appareils pris en charge: 1 technologie Nifty améliorant les performances Solide sur le front de la confidentialité Le logiciel a peu de contrôles de bas niveau Pas de joie avec Netflix Speedify, comme son nom l'indique, a un objectif principal en tant que fournisseur VPN gratuit: garantir que pendant que vous bénéficiez du cryptage , votre connexion Internet reste aussi rapide que possible. À cette fin, ce fournisseur utilisera toutes les connexions Internet disponibles pour obtenir les meilleures performances possibles, en combinant potentiellement, par exemple, une connexion Ethernet (haut débit fixe) avec une connexion 3G / 4G mobile attachée. Même si vous ne disposez que d'un seul type de connexion Internet, la firme affirme que sa technologie de turbocompresseur aidera toujours à accélérer les choses. Le plan gratuit offre un accès complet à ces serveurs (tout comme avec les options d'abonnement), la seule restriction de l'offre gratuite étant que vous êtes limité dans la quantité de données que vous pouvez télécharger. Les utilisateurs gratuits obtiennent 5 Go de données chaque mois, mais cela tombe à 1 Go au cours des mois suivants. Ce n'est pas une énorme allocation, et certainement pas autant que certains autres rivaux que vous verrez ailleurs sur cette page, mais c'est plus que certains, et encore assez pour couvrir certaines fonctions de base de navigation et de messagerie. Et ce fournisseur VPN mérite certainement un coup d'œil sur le front des performances, car lors de nos tests, les technologies susmentionnées d'attribution de vitesse se sont effectivement révélées avoir un effet positif. Vous voulez essayer Speedify? Vous pouvez le télécharger ici Une bonne gamme de clients et une bande passante illimitée - il y a beaucoup à aimer ici sur ProtonVPN 5. ProtonVPN gratuit Vous ne serez pas contraint par une allocation mensuelle de données avec ce VPN gratuit Nombre de serveurs: 628 | Emplacements des serveurs: 44 | Adresses IP: N / A | Nombre maximum d'appareils pris en charge: 5 Aucune limite de données mensuelle Excellente sur le plan de la confidentialité Une limite d'appareil Seulement trois emplacements à choisir parmi ProtonVPN est un autre fournisseur qui propose un VPN gratuit en plus d'une option payante, mais le premier a quelques points très forts, le plus notable de c'est-à-dire qu'il n'impose aucune restriction de bande passante. En d'autres termes, vous êtes libre d'utiliser autant de données que vous le souhaitez chaque mois. Il y a, bien entendu, des limites au plan gratuit pour inciter à la mise à niveau de l'offre payante. Et les restrictions de ProtonVPN Free incluent de vous limiter à un seul appareil, à seulement trois emplacements, et les utilisateurs gratuits ont une priorité inférieure en termes de vitesse par rapport aux abonnés payants. Il n'y a pas non plus de support P2P. Mais si vous pouvez vivre avec cela, c'est un fournisseur impressionnant avec une politique stricte de non-journalisation, et vous pouvez vous inscrire avec rien de plus que votre adresse e-mail. Il n'y a même pas d'annonces sur le site Web, sans parler du client. En parlant de clients, il y en a une bonne gamme - avec des logiciels natifs pour Windows PC, Mac, Linux, iOS et Android - et nous avons constaté que les performances étaient également assez solides. Cependant, les vitesses peuvent chuter aux heures de pointe lorsque de nombreux utilisateurs sont là et que les gens payants ont la priorité; À ce moment, vous pourriez être tenté de passer à un forfait payant. Mais clairement, avec son allocation de données illimitée, c'est un cadeau qui vaut la peine d'être considéré. Vous voulez essayer ProtonVPN Free? Vous pouvez le télécharger ici Hideme ne limitera pas votre connexion et prétend être le «VPN le plus rapide du monde» 6. Vous cachez quelque chose avec ce VPN soucieux de la confidentialité Nombre de serveurs: 1, 500+ | Emplacements des serveurs: 60 | Adresses IP: N / A | Nombre maximum d'appareils pris en charge: 5 Protection de la vie privée Pas de publicité ni de limitation de vitesse Limité à un appareil Seuls trois emplacements proposent des fournisseurs VPN payants et gratuits, ce dernier vous offrant 2 Go de données par mois pour jouer. Il existe également d'autres limites: vous ne pouvez connecter qu'un maximum d'un appareil et vous êtes limité à trois emplacements de serveur (Singapour, Canada et Pays-Bas) plutôt qu'aux 30 emplacements payants pour les abonnés. Sur le plan positif, cependant, ce fournisseur ne limitera pas la vitesse de connexion des utilisateurs gratuits, et promet en outre qu'il ne conserve aucun journal et ne stocke aucune donnée utilisateur, donc ne transmettra aucune donnée à des tiers afin d'essayer et faire un profit (simplement parce qu'il n'a pas de données à transmettre). Il n'y a pas d'annonces ici non plus. Vous obtenez un logiciel natif pour Windows PC et Mac, Android et iOS, le client Windows étant intelligemment conçu, ainsi qu'un support technique 24h / 24 et 7j / 7 (qui est en place même pour les utilisateurs gratuits). Les performances ont également été impressionnantes lors de nos tests. Dans l'ensemble, il s'agit donc d'une offre gratuite plus que solide qui essaie de maintenir votre confidentialité, sans trop de restrictions. Vous voulez essayer Vous pouvez le télécharger ici Besoin d'un VPN facile à utiliser avec de nombreux serveurs? Vous l'avez obtenu avec SurfEasy 7. SurfEasy (Opera Free VPN) Un bon argument pour changer de navigateur? Nombre de serveurs: 1500 | Emplacements des serveurs: 30 | Adresses IP: N / A | Nombre maximum d'appareils pris en charge: 5 Cinq appareils simultanés autorisés Client convivial 500 Mo de données mensuelles Performances pas si chaudes sur des sauts plus longs SurfEasy est un VPN gratuit basé au Canada de la même organisation responsable du navigateur Web Opera, et en fait il est intégré à Opera comme un VPN intégré. Il existe des offres payantes et gratuites, cette dernière ne limitant pas la quantité d'appareils que vous pouvez utiliser - les utilisateurs gratuits peuvent connecter jusqu'à cinq appareils simultanément, tout comme les abonnés payants. Vous bénéficiez également de 1 000 serveurs dans 25 pays et d'un client PC Windows très convivial. Les performances sont suffisamment solides, bien que nous ayons constaté que certains trajets plus longs vers des serveurs plus distants (c'est-à-dire les États-Unis) pourraient être plutôt lents. La principale restriction ici est une limite de données mensuelle de 500 Mo, ce qui signifie que vous n'obtiendrez pas beaucoup de kilométrage sur ce VPN gratuitement, et c'est vraiment pour une utilisation très légère ou occasionnelle uniquement (ou le tester si vous cherchez à la souscription à un plan payant). Il est important de noter, cependant, que si vous utilisez le navigateur Opera avec son VPN intégré, il n'y a pas de limite de données ici (au moins pour protéger vos activités de navigation). Quel pourrait être un argument convaincant pour passer de Chrome ou Firefox… Vous voulez essayer SurfEasy? Vous pouvez le télécharger ici PrivateTunnel est un VPN gratuit qui offre une protection pour tous vos appareils - de bureau et mobiles 8. PrivateTunnel Un VPN gratuit qui gardera vos données et votre identité en toute sécurité sur n'importe quel PC ou appareil mobile Nombre de serveurs: 50 | Emplacements des serveurs: 23 | Adresses IP: N / A | Nombre maximal d'appareils pris en charge: 3 Large gamme de clients Simple à utiliser Choix limité d'emplacements Performances incohérentes par moments Comme certains des autres fournisseurs de VPN gratuits présentés dans ce tour d'horizon, PrivateTunnel est disponible pour un certain nombre de plates-formes - en particulier Windows PC, Mac, Android et iOS. Une autre caractéristique partagée par nombre de ses contemporains est l'existence d'un forfait limité et gratuit en plus des abonnements payants. Eh bien, en quelque sorte. Plutôt que d'offrir un forfait d'abonnement mensuel traditionnel, vous disposez plutôt de 200 Mo de données non expirées à utiliser comme vous le souhaitez. Lorsque cela se termine, vous pouvez acheter plus de données en paquets de 20 Go ou 100 Go. Si vous sentez que vous souhaitez utiliser PrivateTunnel tout le temps, vous pouvez opter pour un forfait de 30 $ par an qui vous donne des données illimitées - voyez les 200 Mo comme une session de dégustation pour voir si vous aimez tout. En tant que VPN, PrivateTunnel fonctionne assez bien, bien que les connexions puissent parfois être un peu capricieuses. Tout est très facile à utiliser, il n'y a donc aucune raison de ne pas le prendre pour un essai routier. Vous voulez essayer PrivateTunnel? Vous pouvez le télécharger ici. Nous avons également examiné des dizaines de fournisseurs de VPN et répertorié les meilleurs dans notre guide du meilleur acheteur de VPN mis à jour. Comment choisir un VPN gratuit: 5 questions incontournables Le couple d'années a vu la montée des menaces mondiales à la vie privée des individus avec des droits longtemps maintenus à l'anonymat et à la neutralité du net sapés avec un manteau de légitimité. Bien que les VPN - réseaux privés virtuels - ne soient pas la panacée pour être sûr, sécurisé et privé sur Internet, il est un élément essentiel de l'arsenal pour les individus enclins à rechercher ces libertés. Si vous n'avez pas encore de VPN, vous pouvez en obtenir un gratuitement, sans avoir à payer un seul centime pour un. Soyez prudent, car tous les fournisseurs de VPN gratuits ne sont pas créés égaux et certains peuvent même compromettre votre sécurité. Voici cinq questions que vous devez vous poser avant de télécharger et d'installer une. 1. Quel est son modèle économique? Les fournisseurs de VPN en ont pour leur argent et gérer une telle entreprise coûte beaucoup, surtout si elle est populaire. Certains, comme Tunnelbear, utiliseront gratuitement, tout comme Dropbox, comme outil marketing pour inciter les clients potentiels à passer à une version payante une fois qu'ils seront satisfaits de la version gratuite. Cependant, la plupart vendront des données utilisateur ou fourniront quelque chose à un tiers qui, encore une fois, compromettra votre vie privée. 2. Comment protège-t-il mon PC? La plupart des fournisseurs VPN utilisent généralement une application de bureau qui s'exécute en arrière-plan pour crypter vos données lorsque vous surfez sur le Web. Cependant, cela ne résout qu'une partie du problème. Votre ordinateur portable peut toujours avoir des empreintes digitales en raison de la permissivité des solutions de suivi qui peuvent être trouvées sur presque tous les sites Web en ligne. Certains, dont WIndscribe, ont une approche plus holistique en intégrant l'équivalent d'un super bloqueur de publicités 3. Qu'est-ce que je perds en devenant libre? Habituellement, on peut s'attendre à ce qu'un produit gratuit ait des coins coupés et c'est en effet le cas pour tous les fournisseurs de VPN. Certains offrent plus de bande passante gratuite que d'autres, les principaux emplacements et même le blocage des publicités, le P2P et le pare-feu avec un chemin de mise à niveau facile à payer qui déverrouille une bande passante illimitée avec plus d'emplacements et de configurations OpenVPN. 4. Votre fournisseur enregistre-t-il quelque chose? Assurez-vous que votre fournisseur ne stocke pas l'activité Internet des utilisateurs. Vous pouvez généralement vérifier cela dans la page des conditions générales ou dans le contrat de licence utilisateur final, communément appelé CLUF. Malheureusement, de nombreux fournisseurs de VPN préfèrent frustrer les utilisateurs finaux avec de longues conditions générales ou des déclarations de confidentialité qui cachent souvent des détails importants sur leur fonctionnement. À l'autre extrémité du spectre se trouvent les fournisseurs de VPN qui effaceront tout après la fermeture de votre session et ne garderont pas de journaux. 5. Puis-je m'inscrire de manière totalement anonyme? Avoir un fournisseur VPN auquel vous pouvez vous abonner sans adresse e-mail et qui accepte les paiements Bitcoin, pour une confidentialité maximale, est à peu près le meilleur que vous puissiez attendre en ligne. Certains fournisseurs proposent également un double saut où vous pouvez obscurcir davantage votre trafic en doublant essentiellement la confidentialité. Vous recherchez un VPN pour votre smartphone ou tablette? Rendez-vous ensuite dans l'un de nos guides pour: Les meilleures applications VPN pour iPhone Les meilleures applications VPN pour Android.

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